Ваш браузер устарел и не обеспечивает полноценную и безопасную работу с сайтом.
Установите актуальную версию вашего браузера или одну из современных альтернатив.
Изучение влияния микрогравитации как фактора космических полетов (КП) на организм человека свидетельствует об изменении состава лейкоцитов периферической крови, в том числе увеличении количества гранулоцитов [1], снижении содержания Т-клеток [2, 3] и моноцитов [1]. Помимо этого широкую известность имеет феномен «анемии космических полетов» [4]. Это явление считалось кратковременным, а его причиной считалась острая адаптация к гемодинамическим событиям [5]. Однако недавнее исследование свидетельствует об увеличении скорости разрушения эритроцитов при 6-месячных миссиях космонавтов на борту Международной Космической станции [6].
Все обнаруженные изменения могут быть связаны с функционированием гемопоэтической ниши, в которой происходит образование и созревание клеток крови. Данные по гемопоэтическим стволовым и прогениторным клеткам (ГСПК) после КП и моделирования эффектов микрогравитации ограничены, однако считается, что ГСПК могут быть подвержены влиянию невесомости, поскольку реагируют на присутствие механических нагрузок [7]. Важную роль для поддержания ГСПК играют мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) [8], которые также являются гравичувствительными [9]. Поэтому изучение их взаимодействия является особенно актуальной задачей.
Ранее в нашей лаборатории была показана invitro экспансия ГСПК при сокультивировании мононуклеаров пуповинной крови (пкМНК) и МСК, выделенных из стромально-васкулярной фракции жировой ткани [10]. В результате сокультивирования образуются две отличающиеся по свойствам и пролиферативному потенциалу популяции гемопоэтических клеток: суспензионные и МСК-ассоциированные ГСПК. Эта модель была адаптирована для исследований эффектов моделирумой микрогравитации на устройстве случайного позиционирования (Random Positioning Machine (RPM)) [11].
Целью данной работы было оценить динамику гемопоэз-поддерживающей функции МСК в invitro модели гемопоэтической ниши для изучения эффектов микрогравитации.
МСК, полученные из стромально-васкулярной фракции жировой ткани, сокультивировали с пкМНК, которые были предоставлены Банком стволовых клеток «Криоцентр» (г.Москва), в среде RPMI 1640 с добавлением 2мМ L-глутамина, 5000 мкг/мл стрептомицина, 5000 ед/мл пенициллина и инактивированной 10 % ФБС. После 72 ч сокультивирования неадгезировавшие к МСК клетки удаляли, а флаконы с адгезировавшими пкМНК полностью заполняли ростовой средой, насыщали CO2 в инкубаторе и продолжали культивировать в статическом контроле (СК) и на устройстве случайного позиционирования — Gravite (Space Bio-Laboratories, Япония) для моделирования эффектов микрогравитации (ММГ) в течение 7, 14 и 21 суток.
Оценивали количество суспензионных ГСПК, ассоциатов ГСПК и МСК. Проводили функциональный анализ суспензионных клеток с помощью клоногенного теста с использованием среды HSC005 (Human Methylcellulose Enriched Media HSC005, R&D Systems, США). Ассоциаты МСК и ГСПК разделяли с помощью иммуномагнитной сепарации на колонках (Miltenyi Biotec, Германия) с использованием CD45 микросфер согласно протоколу производителя. После сепарации оценивали количество МСК-ассоциированных гемопоэтических клеток. В среде культивирования оценивали концентрацию глюкозы и лактата.
Количество ассоциатов МСК-ГСПК снижалось к 21 суткам как в СК, так и ММГ. При этом экспозиция на RPM не оказала значительных эффектов. В статическом контроле наблюдалось увеличение количества МСК-ассоциированных ГСПК (CD45+) на 14 сутки и снижение к 21 суткам экспозиции. При ММГ произошло значительное снижение МСК-ассоциированных ГСПК к 21 суткам сокультивирования. При этом на 14 и 21 сутки в группе ММГ было достоверно снижено количество ассоциированных с МСК гемопоэтических клеток по сравнению со статическим контролем.
Изменение количества суспензионных клеток в СК также носило колоколообразный характер с пиком на 14 сутки сокультивирования. В группе ММГ происходило значительное снижение количества суспензионных ГСПК к 21 суткам. По сравнению со статическим контролем экспозиция на RPM привела к снижению количества суспензионных клеток только на 14 сутки экспансии. Общее количество гемопоэтических предшественников или КОЕ в группе СК снижалось к 21 суткам экспансии. При этом при ММГ не наблюдалось изменений при увеличении продолжительности экспозиции. Однако по сравнению со статическим контролем выявлено достоверное снижение количества КОЕ на 7 и 14 сутки экспозиции на RPM. Схожий характер носило и изменение количества клеток в колониях.
На всех выбранных сроках сокультивирования не было отмечено критичного снижения концентрации глюкозы в среде, что позволит использовать данную модель и на более продолжительных сроках. Увеличение срока культивирования вызывало накопление лактата в кондиционированной среде, максимально на 21 сутки.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наибольшем образовании МСК-ассоциированных, суспензионных ГСПК и КОЕ на 14 сутки сокультивирования с дальнейшим снижением гемопоэз-поддерживающей активности на 21 сутки. При ММГ наблюдалась схожая динамика, однако на каждом из сроков культивирования снижалась гемопоэз-поддерживающая активность по сравнению со статическим контролем.
