Ваш браузер устарел и не обеспечивает полноценную и безопасную работу с сайтом.
Установите актуальную версию вашего браузера или одну из современных альтернатив.
Т-лимфоциты (Т-клетки) играют решающую роль в процессах развития адаптивного иммунного ответа и выполняют свои функции через цитоскелет-опосредованные взаимодействия с другими клетками иммунной системы. Эти межклеточные взаимодействия могут быть нарушены в условиях орбитальной микрогравитации (MG).
Для моделирования невесомости in vitro (ivSMG) при инкубации Т-клеток, были применены две ротационные платформы: клиностат (CL) и установка случайного позиционирования (RPM) с последующим выделением и секвенированием тотальной РНК (RNA-seq) и анализом общего транскриптома Т-клеток.
Организация и функционирование клеточного цитоскелета детерминируют несколько жизненно важных и патологических процессов, в том числе транскрипцию генов, рост, адгезию и подвижность клеток, развитие иммунного ответа, апоптоз и канцерогенез [1].
Данные транскриптомного анализа, а также профилирование экспрессии генов компонентов цитоскелета и родственных генов с использованием количественного метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (RT-qPCR) подтвердили участие дифференциально экспрессированных генов цитоскелета в Т-клеточном ответе на условия ivSMG.
Кроме того, для каждой из использованных платформ был определён ряд дифференциально экспрессированных генов (DEGs) ответа на ivSMG, участвующих в различных клеточных путях передачи сигнала и потенциально вовлечённых в гравитационную сенсорику Т-клеток.
Получение мышиных Т-клеток. Тимоциты (Т-клетки) выделяли из трех мышей C57BL/6 дикого типа в возрасте 2,5 месяцев. Клетки ресуспендировали в стерильном PBS, затем разводили до конечной концентрации 2 млн. клеток/мл в стерильной культуральной среде RPMI-1640 (Gibco), содержащей 10% FBS, 0,1 М HEPES (рН 7,4) и использовали для всех условий эксперимента и контроля.
Экспериментальные платформы. Клиностат (CL) и установка случайного позиционирования (RPM) использовались в сравнительном исследовании для моделирования невесомости in vitro в наземной лаборатории и инкубации суспензионной клеточной культуры Т-клеток мыши в условиях ivSMG, как описано ранее [2]. Применяемые режимы были следующими: 60 об/мин для CL, постоянно вращающегося вокруг одной оси вращения, перпендикулярной направлению вектора силы тяжести, 12 об/мин для RPM, вращающегося вокруг 2 осей вращения с постоянной скоростью и 180 об/мин для контрольной платформы, постоянно вращающейся вокруг одной оси вращения, параллельной направлению вектора силы тяжести.
Экстракция РНК. Тотальную РНК выделяли из T-клеток с использованием реактивов RNeasy kit #74104 (QIAGEN). Чтобы избежать загрязнения геномной ДНК, каждый образец РНК обрабатывали ДНК-нуклеазой с использованием RNAse-free DNAse kit, № 79254 (QIAGEN). Концентрацию очищенной тотальной РНК измеряли с помощью NanoDrop2000 (Thermo Scientific). Качество препарата РНК визуально оценивали с помощью агарозного гель-электрофореза (1% UltraPureAgarose, № 16500500 (Invitrogen)) в 1xTAE. Изображения геля были анализировались с помощью системы ImageQuant LAS 4000 LAS4000 Image с использованием программы ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).
Анализ экспрессии генов с помощью ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR). Для каждой реакции синтеза кДНК использовали 2 мкг общей РНК на образец. Реакции RT-qPCR проводили с использованием набора SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix, #1725272SP (Bio-Rad) в ПЦР системе RT-PCR C1000/CFX96 (Bio-Rad). Профилирование экспрессии генов с помощью количественной ПЦР в реальном времени выполняли, как описано ранее [3]. Данные об экспрессии генов — среднее значение для технических трипликат и стандартное отклонение между значениями экспрессии генов биологических трипликат рассчитывались и анализировались в Excel.
РНК-секвенирование и биоинформатический анализ. Секвенирование РНК и контроль качества данных выполняли с помощью платформы Illumina HiSeq-PE150. Стандартный биоинформатический анализ данных секвенирования РНК включал в себя первичную фильтрацию данных для удаления последовательностей адаптеров, контаминаций, выравнивания и распределения РНК-последовательностей по всему геному. Анализ дифференциальной экспрессии гена RNA-seq проводили, как описано [4]. Функциональная классификация уточненных данных для результирующих генов выполнялась с использованием ресурса NCBI Gene; списки генов составлялись и анализировались в Excel.
Секвенирование РНК (RNA-seq) с последующим анализом дифференциальной экспрессии генов выявило паттерны DEGs в условиях ivSMG в каждой из ротационных платформ — в клиностате (CL) и в установке случайного позиционирования (RPM).
Набор из 65 дифференциально экспрессированных генов (DEGs), общих для генных паттернов, полученных в CL и в RPM платформах, включает в себя гены-кандидаты специфического ответа транскриптома Т-клеток мыши на экспериментальные условия ivSMG. Было показано, что 18 из этих 65 общих генов обильно экспрессированы в тимусе мыши [5], тогда как другие 47 генов демонстрируют низкую экспрессию или ещё не были охарактеризованы в мышиных тимоцитах.
По крайней мере, 14 из выявленных генов являются компонентами клеточного цитоскелета или связаны с цитоскелетом, и по крайней мере 13 из найденных генов являются важными регуляторами путей передачи сигнала в клетках. 8 из идентифицированных генов участвуют в метаболических путях, другие 18 выявленных генов представляют собой некодирующие РНК (ncRNA) с потенциальными регуляторными функциями.
Была исследована реакция культивируемых мышиных Т-клеток на уровне глобального транскриптома на моделируемую микрогравитацию in vitro (ivSMG) и были обнаружены новые наборы генов с дифференциальной экспрессией в Т-клетках в ротационных платформах, генерирующих условия ivSMG по сравнению с уровнем генной экспрессии в контрольной платформе. Эти транскрипты представляют собой новые гены-кандидаты, потенциально участвующие в реакции клеток на микрогравитацию, однако характер экспрессии генов может отличаться в условиях космоса и, следовательно, полученные данные нуждаются в дальнейшей валидации в орбитальных экспериментах.
